凝膠電泳法檢測內毒素

凝膠電泳法

當將含有細菌內毒素的溶液與裂解物混合後進行孵育時,方法A和B取決于牢固凝膠的形成。方法A作爲極限測試進行,其中受檢制劑的兩種重複溶液中所含的內毒素的濃度均應低于各論中規定的內毒素極限濃度。方法B半定量測定所檢查制劑中的內毒素濃度。
 

裂解液的敏感性

在測試中使用每批裂解物至少一個小瓶之前,請確認每批新裂解物的標記靈敏度。准備一系列的CSE稀釋液,使濃度分別爲2λ,λ,0.5λ和0.25λ,其中λ是裂解液在EU中每毫升的標記靈敏度。對這四個標准濃度一式兩份,按照方法給出的方法進行測試,並包括由水BET組成的陰性對照。至少每個系列中的**終稀釋液**給出陰性結果。

计算在发现阳性结果的每个稀释系列中**低内毒素浓度的对数平均值。几何平均终点浓度是裂解液的测量灵敏度,以ED / ml为单位,可使用以下表达式计算:

几何平均终点浓度=反对数(∑e / f)
其中,∑e =对数之和使用的一系列稀释液的终点浓度
f =复制试管的数量。
該平均值給出了估計的裂解物敏感性,**在0.5λ和2λ之間。

測試幹擾因素

應牢記某些因素幹擾細菌內毒素測試的可能性。爲了驗證測試結果,**證明測試制劑不會抑制或增強反應或以其他方式幹擾測試。的驗證如果裂解物的供應商或制造或樣品的制劑的方法改變**被重複。
用水BET稀釋測試制劑是克服抑制作用的**簡單方法。

允許的稀釋水平或**大有效稀釋度(MVD)取決于産品的濃度,産品的內毒素極限和裂解物的敏感性。它由以下表達式計算:

MVD =内毒素极限x测试溶液的浓度
凝胶凝结法-浓缩                                                        λ
准備測試溶液。如表中所示准備溶液A到D的重複樣品。
 
溶液A =稀释度等于或低于MVD的产品溶液(测试溶液)。
溶液B =加标有指定CSE浓度的测试溶液(正产品控制; PPC)。
溶液C =在水BET中具有指示的CSE浓度的标准溶液。
溶液D =水BET(阴性对照; NC)。

方法 

在試管,小瓶或微量滴定板孔等容器中執行以下步驟。在每個選定的容器中,添加適量的陰性對照(NC),水BET中的標准CSE溶液,測試溶液和陽性産品對照(PPC)。除非使用單個測試瓶,否則應間隔一定時間以允許讀取每個結果,向每個容器中添加等體積的適當構成的裂解液。輕輕地混合樣品裂解物混合物,然後放置在諸如水浴或加熱塊的培養裝置中,准確記錄放置容器的時間。將每個容器在不受幹擾的37°±10孵育60±2分鍾。取下容器並仔細檢查內容物。

 
將此結果記錄爲正(+)。陰性結果的特征是不存在這種凝膠或形成不保持其完整性的粘性凝膠。將這樣的結果記錄爲負(-)。小心處理容器,避免使它們遭受不必要的振動,因爲可能導致錯誤的負面觀察。

通過使用在裂解物敏感性下描述的公式,計算C帶系列溶液的幾何平均終點濃度。

計算和結果解釋

如果
(a)系列A和D的解決方案給出否定的結果,則幹擾因素的檢驗是有效的;
(b)用C系列溶液獲得的結果證實了裂解物的標記靈敏度;
(c)B系列溶液終點濃度的幾何平均值不大于21或不小于0.51。

如果獲得的結果超出規定的範圍,則所檢測的測試制劑將充當抑制劑或活化劑。可以通過進一步稀釋(不超過MVD),過濾,中和,滅活或通過去除幹擾物質來消除幹擾因素。使用更敏感的裂解液可以對所檢查的制劑進行更大的稀釋。如果幹擾因素通過標稱分離極限的分子量對應于10,000到20,000的過濾器,例如三乙酸纖維素的不對稱膜過濾器,則可以使用超濾。 
 
应该检查这种过滤器是否存在任何导致假阳性结果的因素。用水BET或pH 7.4 BET的三氯化物缓冲液冲洗保留在过滤器上的含有内毒素的物质。内毒素在水BET或缓冲液中回收。确定每种待测制剂的测试体积和**终体积中的内毒素浓度。

通過使用添加了CSE並已提交給所選治療方法的待測制劑,通過重複進行幹擾因子測試,確定所選治療方法可有效消除幹擾,而不會去除內毒素。